거대분자 연구에 이용되는 물리적 기술들

-. 원심분리는 거대분자를 분리할 수 있으며, 거대분자의 크기와 형태에 대한 정보를 얻을 수 있다. 

 거대분자의 몇몇 중요한 특성들은 원심분리 영역에서 침전하는 속도를 측정하면 알 수 있다. 침전 연구는 일반적인 연구실 원심분리기로는 할 수 없다. 이는 확산에 의해서 무작위로 분자들이 위치하지 않도록 충분히 빠르게 분자들을 침전시키기 위한 원심분리 에너지를 일반적인 연구실 원심분리기가 만들어 낼 수 없기 때문이다. 그러나 최신 초고속 원심분리기의 경우 중력의 800,000배가 되는 에너지까지 만들 수 있는데, 이러한 힘은 용액 속에서 거대분자를 침전시키기에 충분하다. 

 분자의 침전 속도는 분자의 무게와 형태에 따라 달라진다. 만약 두 입자가 같은 모양을 가지더라도 하나의 분자량이 더 크면 분자량이 작은 것보다 더 빨리 침전된다. 반면 분자량이 같은 두 분자의 침전속도는 더 촘촘한 모양을 가진 입자가 원심력에 의한 영향 아래 빨리 침전된다. 더 촘촘한 입자의 이동이 마찰에 의한 영향을 적게 받으므로 형태 역시 침전속도에 영향을 끼친다. 

 원심분리 에너지에 대한 침전속도 비율을 침강상수라고 한다. 

 이는 s = 속도/원심분리 원동력

 개개의 입자에 대한 s 값은 많은 다른 용액에서도 흔히 같이 나타남으로 s 값은 흔히 분자의 특성을 나타내는 상수로써 여겨진다. 더욱이 s 값은 분자량과 형태에 의해 결정되기 때문에, 실험 조건들이 다양해짐으로써 발생하는 s 값의 변화는 분자배열이나 구조의 변화를 모니터하는 데 이용할 수 있다. 

 분자생물학 연구실에서는 두 가지 원심분리 기술이 종종 이용된다. 첫 번째 기술은 설탕 구배 원심분리법(sucrose gradient centrifugation)이다. 원심분리 튜브는 설탕 용액으로 채워져 있는데, 농도는 튜브의 위쪽에서 아래쪽으로 계속 증가하게 된다. 실험하는 단백질, 핵산, 핵단백질을 조심스럽게 설탕 구배 위에 밴드를 형성할 수 있도록 올려놓는다. 시료를 올려놓은 후, 그 튜브를 핀으로 고정되는 bucket을 가지는 원심분리 머리모양의 한 형태인 swing bucket rotor에서 놓고, rotor를 원심분리기에 위치시킨다. swing bucket rotor가 회전함에 따라 bucket 들도 이음쇠에 의해 수평 회전하여 튜브가 수평 위치가 되게 된다. 원심분리 후, bucket은 수직 위치로 다시 돌아오고 그 안의 튜브를 회수한다. 튜브 바닥에 작은 구멍을 뚫고, 구멍을 통해 떨어지는 용액 방울들을 모은다. 이렇게 떨어지는 용액 방울들은 튜브에서의 용액의 연속적인 층을 나타내는데 이를 분석하여 거대분자의 농도를 측정한다. 

 두 번째 원심분리 기술은 밀도 평형 원심분리(equilibrium density gradient centrifugation)이다. 이 방법에서는, 핵산 또는 핵단백질을 그들의 밀도와 비슷하게 평형을 이루기 위해 선택된 농도의 CsCl 용액에 현탁시킨다. 강력한 원심력 영향하에, CS+와 Cl- 이온은 어느 정도까지 원심분리 아래쪽으로 향하여 이동하게 된다. 그러나 원심분리기 튜브의 바닥에 축적되지는 않는다. 왜냐하면 원심력은 이온의 일정한 분포를 유지하는 확산 현상을 상쇄시킬 만큼 충분하지 않기 때문이다. 그 결과 몇 시간 후에 이온들은 원심분리 튜브 안에서 거의 직선에 가까운 농도구배와 밀도구배가 있는 평형 농도 분포를 이룬다. 

 밀도는 튜브의 바닥에서 최대이다. 밀도구배가 형성됨에 따라, 고분자들은 이동하기 시작한다. 튜브의 위쪽에 있는 것들이 아래를 향하여 이동하여, 그들의 밀도가 용액 밀도와 평형을 이루는 위치에서 멈춘다. 비슷하게, 튜브의 낮은 부분에서 고분자는 위쪽을 향해서 움직이다가 같은 밀도의 위치에서 멈춘다. 이러한 방법으로 고분자들은 튜브에서 하나의 좁은 띠를 형성한다. 만일 용액이 다른 밀도를 가지는 고분자를 포함한다면, 각각의 고분자들은 각자의 밀도에 맞는 구배 위치에 각각의 띠를 형성하고, 따라서 고분자는 분리될 수 있다. 

 이 기술의 분석력은 대단하다. 예를 들어, 단일 가닥 DNA 염기 내에 존재하는 질소 동위원소에 의한 차이를 분리할 수 있다. 

-. 겔 전기영동은 전기적 영역에서 이동 속도 차이로 핵산을 분리한다. 

 겔 전기영동은 DNA 또는 RNA의 길이에 따라 분리할 수 있다. 맨 위에 작은 홈이 있는 겔을 유리 혹은 플라스틱 지지대에 준비한다. 겔과 지지대를 완충 용액에 담그고, 샘플을 홈에 넣고 전기영동 장치를 작동시킨다. 음전하를 가진 핵산은 겔을 통과하며 양전하 쪽으로 이동하게 된다. 핵산의 이동 속도는 핵산 전체의 전하와 모양에 따라 이동 속도에 차이가 생긴다. 또한 이동 속도는 분자량에 영향을 받는데, 이는 마찰에 의해서 끌리는 데 영향을 끼치는 표면적이 질량에 따라 증가하기 때문이다. 작은 분자는 겔의 좁은 공간과 구불구불한 미로를 큰 분자보다 더 쉽게 통과할 수 있다. 따라서 이동 속도는 분자량이 감소함으로써 증가하게 된다. 

 DNA 밴드는 ethidium bromide를 이용해 염색하여 관찰할 수 있는데 DNA & ehidium bromide 복합체는 자외선에 의해 형광을 나타내기 때문이다. 검출의 민감도는 매우 높아서 적은 시료도 쉽게 볼 수 있다. ethidium bromide는 발암물질이므로, 실험자들은 상업적으로 제공되는 좀 더 안전한 대체물질로 작업하기도 한다. 전기영동 조건을 조절함으로써 단일 가닥의 핵산 또는 이중가닥 핵산의 길이에 따라서 이동 속도를 조절할 수 있다. 겔 전기영동은 또한 토포이성질체를 분리할 수 있다. 

 겔 전기영동 기술은 크기에 의해서 DNA 분자를 구분하는데 매우 효과적인 데 비해 느리고, 자동화하기 어렵고, 정량적인 데이터를 얻기 어렵다. 전기적 영역에서 DNA를 분리하는 또 다른 방법인 모세관 전기영동은 이러한 단점이 없다.