핵산의 분리

 DNA 분리 방법은 해당 유기체에 적합하게 조절되어야 한다. 

 많은 분자생물학 실험에서 필수적인 단계인 DNA 분리는 관심이 가는 바이러스 또는 세포로부터 DNA가 분리되어 나오는 데서 시작되며 이때 흔히 단백질, RNA와 같은 다른 생체분자 물질도 같이 나온다. 유기체의 구조와 구성은 다양하기 때문에, DNA는 얻고자 하는 유기체에 따라서 DNA의 분리 방법이 달라져야 한다. DNA가 어떻게 감싸져 있는지와 DNA 건조 무게의 비율에 따라서 DNA 분리 방법을 선택해야 한다. DNA에 절단을 일으킬 수 있는 과도한 뒤섞임과 유체역학에 의한 전단력이 발생하는 방법들은 주의해야 한다. 다음은 바이러스, 세균, 플라스미드, 효모로부터 DNA를 분리하는 방법들이다. 

 1. 바이러스 DNA. 바이러스 입자가 녹아 있는 수용액을 물과 약간의 수화성이 있는 시약인 페놀과 섞어 준다. 소량이 페놀이 수용액 층으로 들어가 단백질 막을 부수고, 단백질 분자들을 변성시킨다. 변성된 단백질은 페놀층으로 들어가거나, 페놀과 수용액의 중간층에 침전된다. 페놀층으로부터 DNA가 녹아 있는 위쪽의 수용액 층을 조심스럽게 분리한 후, DNA를 침전시키기 위해 에탄올을 첨가한다. 원심분리에 의해 모인 DNA를 수용성 완충용액에 녹인다. 

 2. 세균 DNA. 세균 세포 내의 DNA는 세포벽과 세포막으로 구성된 세포 외피로 둘러싸여 있다. 페놀만으로는 세포외피를 제거할 수 없다. 따라서 세포벽을 분해하는 라이소자임을 먼저 처리한 후, sodium dodecylsulfate와 같은 계면활성제를 처리하여 세포막을 파괴함으로써 세포외피를 제거할 수 있다. 이후, 페놀을 조심스럽게 섞어 준 후 기다리면 페놀층과 수용액 층이 분리된다. 수용액 층을 회수하여, DNA와 RNA를 침전시키기 위해 에탄올을 첨가한다. DNA와 오염된 소량의 RNA가 포함된 침전물을 유리 막대를 이용하여 건져내고 같이 딸려 나온 에탄올을 제거한다. 그리고 건져낸 DNA로부터 오염된 RNA를 제거하기 위해 RNase가 첨가된 완충용액에 녹인다. Chloroform을 조심스럽게 첨가한 후, 층이 나누어지면 상층액을 분리하고 이 상층액에 에탄올을 첨가하여 DNA를 침전시킨다. 침전된 DNA는 유리막대를 이용하여 건져낸 후 수용성 완충용액에 녹인다. 

 3. 플라스미드 DNA. 박테리아 현탄액에 먼저 세포벽을 분해하는 라이소자임을 처리함으로써 박테리아로부터 플라스미드 DNA가 나오게 된다. 그다음, SDS-sodium hydroxide 용액을 첨가한다. SDS는 세포막을 파괴하고, sodium hydroxide는 RNA를 가수분해하여 2'-와, 3' 뉴클레오시드 1 인산의 혼합물이 되게 한다. DNA는 2번 탄소에 수산기가 없는 deoxyribose이기 때문에 가수분해되지 않고 변성되어 두 가닥으로 완전히 분리된다. 그러나 공유 결합으로 이어진 원형의 플라스미드 DNA는 서로 엉킨 형태로 유지되며 이를 중화시키기 위한 산이 첨가될 때 엉켜 있던 플라스미드 DNA는 온전한 상태로 돌아오지만 세균 DNA는 변성된 단백질과 같이 원심분리에 의해 제거되는 불용성 덩어리를 형성한다. 용해된 플라스미드 DNA는 에탄올을 첨가함으로써 침전되고, 원심분리를 통해 모은 후, 수용성 완충용액에 다시 용해시킨다. 

 4. 효모와 곰팡이 DNA. 효모와 곰팡이의 세포벽을 구성하는 polysaccharide는 라이소자임에 의해 분해되지 않는다. 그러나 다른 효소에 의해 세포벽이 분해되고, 세포벽이 파괴되면 이후 과정은 세균에서 사용되는 방법과 유사하다. 

 RNA는 분리하는 동안 분해되는 것을 막기 위해 많은 주의를 해야 한다. 

 RNA를 분리할 때 가장 주의해야 할 점 중 하나가 분리 과정 동안 방출된 RNase에 의해 RNA가 분해되는 것이다. 이 문제는 액체 질소를 이용하여 세포를 얼린 다음 막자사발에 옮긴 후, 세포를 막자로 가는 것으로 해결될 수 있다. 잘게 빻아진 세포들은 guanidinium thiocyanate, sodium acetate, phenol 그리고 chloroform을 포함하고 있는 산성 용매에 현탁 시킨다. 산성 상태의 RNA는 위쪽 수용액 층으로, 대부분의 DNA와 단백질은 아래 유괴 용매 층이나 또는 중간층으로 이동한다. RNA가 녹아 있는 수용액 층을 깨끗한 튜브로 옮긴 후 에탄올 또는 아이소프로판올을 첨가한다. 원심분리를 통해 침전된 RNA를 알코올로 씻은 후, 수용성 완충 용액에 녹인다.

-. 거대분자 연구에 이용되는 물리적 기술들

 거대분자 연구에 다양한 물리적 기술이 이용된다.

 다양한 물리적 기술들이 핵산, 단백질, 핵단백질 연구에 이용된다. 대표적인 네 가지 기술(전자현미경, 밀도구배 침전, 동밀도구배원심분리, 전기영동)이 있다.

전자현미경을 통하여 핵산과 핵단백질 복합체를 관찰할 수 있다. 

세 가지 전자현미경 기술이 핵산과 핵단백질 복합체를 연구하는 데 주로 이용된다

 1. Metal shadowing: Metal shadowing 기술은 생물 시료의 표면을 3차원 이미지로 보여준다. 생물 시료는 반투명 필름 위에 놓여 건조되며, 이는 진공챔버 안에 놓아두는데, 이 챔버 안에는 텅스텐과 같은 중금속 필라멘트들이 가열돼 있다. 이 필라멘트에서 증발한 금속이 생물 시료의 표면에 얇은 금속층을 형성한다. 관찰자는 전자현미경을 사용하여 금속층을 볼 수 있는데, 이 금속층은 생물 시료의 복제판이다. Metal shadowing은 분자 길이와 선형 지형에 대해 알고자 할 때, 또는 매우 긴 분자를 관찰하는 데 있어서 매우 유용한 기술이다. 

 2. Negative staining: Negative stainin은 거대분자나 바이러스 입자를 시각화 하는 또 다른 방법을 제공한다. 거대분자 또는 바이러스 입자를 uranyl acetate와 같은 중금속 이온이 있는 수용액에 녹인다. 이 혼합물을 지지 필름 위에 미세방울 형태로 놓아두고 건조를 시킨다. 중금속 이온은 거대분자 또는 바이러스 입자 주변을 둘러싸게 된다. 단백질 또는 바이러스 입자 주위의 부분은 단백질 또는 바이러스 입자를 덮은 부분보다 중금속 이온의 두께가 두껍게 되고, 시료에 전자빔을 쏘였을 때 거대분자 또는 바이러스 입자가 존재하는 지역이 다른 곳보다 더 많은 전자가 통과하게 된다. 따라서 단백질이나 바이러스 입자의 음화를 얻을 수 있다. 

 3. Cryoelectron microscopy: Cryoelectron microscopy는 단백질과 핵단백질 복합체의 3차원 구조를 얻는 데 이용된다. 이 기술은 특정 단백질 또는 핵단백질 복합체가 녹아 있는 완충 용액 방울을 급격히 냉각시켜서 무작위한 방향들로 얼음의 비결정질의 층이 복합체를 붙잡고 있도록 한다. 사진은 복합체가 손상당하지 않는 매우 적은 양을 조사하는 전자현미경을 이용해 찍는다. 이렇게 얻어진 사진에서는 다른 방향으로 놓인 수백의 단백질 또는 핵단백질 복합체가 보인다.